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本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA。可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。试剂盒中的内毒素清除剂，可最大限度地除去内毒素。从50～100mL大肠杆菌LB培养液中，可快速提取150～250μg高纯度质粒DNA，提取率达85～90%。使用本试剂盒提取的质粒DNA纯度高，可适用于各种常规分子生物学实验，包括酶切、PCR扩增、测序、连接和转化等。

• 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签(每瓶需单独加入60mL无水乙醇)。P1在使用前先加入RNase A(将试剂盒中提供的RNase A全部加入)，混匀，置于2～8℃保存。
  
• 如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
  
• 第一次开盖使用后请将内毒素清除剂于2～8℃保存，可以缩短使用时的冰上预冷时间。
  
• 使用前请先检查P2和P3是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。P2、P3、漂洗液使用后应立即拧紧盖子。
  
• 洗脱缓仲液体积不应少干500μL，体积过小影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低干7.0会降低洗脱效率，DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
  
• 如果所提质粒为低拷贝质粒或＞10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用100～200mL过夜培养物，同时按照比例增加P1、P2和P3的用量，吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。

• 取50～100mL细菌培养物，11000rpm离心1min，尺量吸除上清。
  
  菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。
• 向留有菌体沉淀的离心管中加入4mL P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
  
  如菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
• 向离心管中加入4mL P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解。
  
  混匀一定要温和，以免污染细菌基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5min，以免质粒被破坏。
• 向离心管中加人4mL P3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。11000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
  
  P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
• 加入上清1/5体积的冰上预冷的内毒素清除剂，振荡混匀溶液变浑浊，冰浴5～10min至溶液变清亮。
  
• 37℃水浴5min，不时振荡，溶液又变浑浊，11000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油相含内毒素。
  
• 将含质粒DNA的上层水相转移至新管，弃下层油相，注意下要吸入油状相。重复抽提三次。即重复步骤5-7三次。
  
• 加入12mL结合液，充分混匀后加入吸附柱(吸附柱放入收集管中).室温放置2min，11000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
• 向吸附柱中加入7mL漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，11000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
  
• 向吸附柱中加入7mL漂洗液，11000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
  
• 11000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验，如酶切、PCR扩增等。
  
• 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加1～2mL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，11000rpm离心2min。
  
• 为增加质粒的回收效率，可将洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置2min，11000rpm离心2min。

得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD₂₆₀处有显著吸收峰，OD₂₆₀值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7～1.9之间，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子的存在会影响吸光值，但并不表示纯度低。